Использование методов in vitro в селекции растений. Посадочный материал голубики Теплица для доращивания in vitro

Что мы делаем, если хотим посадить на своем участке то или иное растение? Обычно мы покупаем семена или готовую рассаду для выращивания трав и овощей, саженцы – для посадки кустарников и деревьев, рассаду или луковицы – для выращивания цветов. Часто ли мы задумываемся над тем, каким образом получена рассада? Оказывается, помимо традиционных черенкования, прививок, выращивания из семян, размножения корневищами, луковицами и т.д. в большинстве стран рассаду многих растений сегодня получают путем микроклонального размножения. Особенно широко этот способ применяется для выращивания растений, которые плохо поддаются размножению другими способами. Также этот метод незаменим, если необходимо постоянно получать в достаточно короткие сроки значительное количество качественной рассады.

С помощью микроклонального размножения (другое название метода – меристемное размножение) выращивают декоративные и плодово-ягодные растения, комнатные и срезочные цветы, картофель и прочие овощи.

Микроклональное размножение растений широко применяется в США, Голландии, Польше, Франции, Японии, Таиланде. В России также накоплен большой опыт по меристемному размножению важных для сельского хозяйства видов растений. Практически во всех российских научно-исследовательских институтах и селекционных центрах созданы лаборатории для микроклонального размножения и оздоровления селекционного материала. Относительно недавно меристемные технологии начали применяться крупными питомниками растений и сельхозпредприятиями. В России наиболее широкое применение меристемная технология пока нашла в получении здоровых семян картофеля.

О методе

Меристема (от греч. meristos - делимый) - это ткань растений, в течение всей жизни сохраняющая способность к образованию новых клеток. Именно за счет меристемы растения растут, образуют новые листья, стебли, корни, цветки.

В процессе роста меристемная ткань в определенной степени сохраняется в некоторых частях растения: в узлах побега, в почках, в кончиках корней, в основаниях черешков листьев или цветоносах и т.д.

Преимущества растений, полученных микроклональным размножением:

Такие растения более здоровые. Они не поражаются вирусами, даже если меристемные ткани были взяты у зараженного растения, так как вирус не поражает меристемы на верхушках побегов.
Урожайность меристемных саженцев выше. Например, с обычного кустика клубники можно собрать 200–300 г ягод, а с меристемного – до 1 кг.
Микроклональное размножение дает возможность получения огромного количества однородных растений за время, при котором не даст того же результата не один другой метод.
Меристемное размножение становится единственно возможным в больших промышленных масштабах, если для размножения берутся растения, которые стерильны и не дают семенного потомства.

Меристемным методом растения размножают в 4 этапа:

Введение: меристемные ткани отделяют от нужного экземпляра растения и помещают на специальные питательные среды в пробирки. Затем меристемные растения выдерживают в специальном шкафу в течение 20-40 дней при освещении до 14 ч. в сутки.
Размножение: через 1-1,5 месяца микрочеренки уже имеют размер горошины, у них образовались зачатки всех вегетативных органов растений. Подрощенные микрочеренки делят на пять-семь частей, а «кусочки» (вновь полученные меристемные черенки) снова проращивают в пробирках в течение 20-30 дней.
Укоренение и адаптация: когда меристемные микрочеренки образуют достаточную корневую систему, их извлекают из пробирок и пересаживают в горшочки, заполненные легким торфом. Затем горшочки устанавливают в защищенную среду - достаточно использовать небольшую пластиковую трубку. Через 4-6 недель микрочеренки привыкают к естественным условиям выращивания.
Подращивание: после укоренения и адаптации новые растения выращиваются при агротехнике, свойственной данной культуре, и могут быть высажены в теплицу, а затем и в открытый грунт.

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: питательная среда содержит минеральные соли и регуляторы роста, при этом в агаризованную питательную среду вводят дополнительно тетраметилтиурамсульфид (ТМТД) в количестве 25-100 мг/л или 25-100 мг/л ТМТД и 1-20 мг/л фундазола, или 25-100 мг/л ТМТД и 1-20 мг/л фундазола в сочетании с 2,5-50 мг/л метиленового синего и 1-10 мг/л бриллиантового зеленого, а в питательную среду с твердым носителем вводят дополнительно 20-100 мг/л ТМТД или 25-100 мг/л нистатина. 2 табл.

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, в частности к способам микроклонального размножения растений и безвирусному семеноводству. Известен способ микроклонального размножения и выращивания растений in vitro путем посадки микрочеренков на питательную среду, содержащую элементы минерального питания по Мурасиге-Скугу и регуляторы роста. Недостатком указанного способа является частое "зарастание" питательной среды микроорганизмами-контаминантами при нарушении условий стерильности. Размножение микроорганизмов приводит к накоплению токсических веществ и вследствие этого гибели части растений и, следовательно, возрастанию затрат для получения необходимого их количества, и(или) для поддержания более высокого уровня стерильности. Цель изобретения - подавление роста микроорганизмов-контаминантов, упрощение способа и снижение затрат при выращивании растений in vitro. Предлагаемый способ выращивания растений in vitro заключается в следующем. Посадка микрочеренков в стерильных условиях производится на питательную среду, содержащую минеральные соли, сахарозу, агар-агар и регуляторы роста, в состав которой дополнительно вводят 25-100 мг/л тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) или ТМТД (25-100 мг/л) и фундазол в количестве 1-20 мг/л или ТМТД(25-100 мг/л) и фундазол (1-20 мг/л) в сочетании с метиленовым синим 2,5-50 мг/л и бриллиантовым зеленым - 1- 10 мг/л. Предлагаемый способ отличается от известного способа выращивания in vitro тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят соединения, обладающие биоцидной активностью против наиболее часто встречающихся в практике микроразмножения растений видов микроорганизмов грибной и бактериальной природы: ТМТД или ТМТД в сочетании с фундазолом или ТМТД в сочетании с фундазолом, метиленовым синим и бриллиантовым зеленым. В результате применения данного способа гибель растений вследствие "зарастания" питательной среды микроорганизмами-контаминантами снижается в 2 и более раз. Соответственно снижаются затраты, необходимые для выращивания дополнительного числа растений. При поддержании коллекций сортов и форм in vitro иногда возникает ситуация "зарастания" всех пробирок данного сорта с угрозой его потери. В случае контаминации чувствительными микроорганизмами черенкование инфицированных растений на предложенную среду позволяет сохранить коллекционный образец. Посадка микрочеренков в стерильных или нестерильных условиях производится на стерилизованный прокаливанием перлитовый песок, пропитанный жидкой минеральной питательной средой без органических добавок, в состав которой дополнительно вводят 20-100 мг/л тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) или 25-100 мг/л нистатина. Применение компонентов с альгицидной активностью - ТМТД или нистатина - устраняет зарастание микроводорослями, выделяющими токсичные для растений соединения, при выращивании в нестерильных условиях или при случайном нарушении стерильности. Это позволяет также последнее микрочеренкование перед высадкой в теплицу проводить в нестерильных условиях, что позволяет упростить способ выращивания за счет более удобных манипуляций с черенками в нестерильных условиях и уменьшить необходимые площади по сравнению с пробирочной культурой. Пример 1. Биоцидные компоненты в указанных табл. 1 и 2 концентрациях были добавлены к питательной среде для микрочеренкования, содержащей минеральные соли по Мурасиге-Скугу и регуляторы роста, а также 7 г/л агар-агара и 20 г/л сахарозы, перед ее стерилизацией автоклавированием (120 o C, 20 мин). Черенки растений картофеля, поддерживавшихся in vitro в стерильной культуре, с одним-двумя междоузлиями высаживали в пробирки с питательной средой и выращивали 3-4 нед при температуре 20 o C и освещенности 5000 лк. Учитывали число случайных зарастаний грибной и бактериальной инфекцией. Как видно из табл. 1, суммарное зарастание контаминантами грибной природы снижается в два и более раз при введении в состав среды ТМТД и фундазола. При этом зарастание Penicillium sp. подавляется полностью (в контроле 1.3%), а рост бактерий изменяется незначительно (табл. 2). Введение в состав среды метиленового синего и бриллиантового зеленого является эффективным в качестве антибактериального средства (табл. 2). Пример 2. Черенки растений картофеля, поддерживавшихся in vitro в стерильной культуре, с одним-двумя междоузлиями нестерильно высаживали на перлитовый субстрат, стерилизованный прокаливанием 2 ч при 170 o C и помещенный в чашки Петри, пропитанный питательной средой, содержащей раствор Кноппа или минеральные соли по Мурасиге-Скугу с добавлением регуляторов роста, а также биоцидных компонентов: 25 мг/л ТМТД или 25 мг/л нистатина. По мере подсыхания субстрата проводили полив дистиллированной водой (примерно, 1 раз в неделю). Через две недели в контрольном варианте (без добавления ТМТД или нистатина) отмечено зарастание микроводорослями, в вариантах с добавлением ТМТД и нистатина зарастание отсутствует, вес надземной части растения составляет 100-180% от контроля. Через 1 мес после посадки в контрольном варианте отмечено бурное развитие микроводорослей на поверхности перлита, растения угнетены, отдельные растения погибли, в опытных вариантах небольшой рост водорослей в местах полива, развитие растений нормальное.

Формула изобретения

Способ выращивания растений in vitro, включающий микрочеренкование и посадку микрочеренков на питательную среду, содержащую минеральные соли и регуляторы роста, отличающийся тем, что посадку микрочеренков осуществляют на агаризованную питательную среду с сахарозой или на питательную среду с твердым носителем, в качестве которого используют перлит, при этом в агаризованную питательную среду вводят дополнительно ТМТД в количестве 25 100 мг/л, или 25 100 мг/л ТМТД и 1 20 мг/л фундазола, или 25 100 мг/л ТМТД и 1 20 мг/л фундазола в сочетании с 2,5 50,0 мг/л метиленового синего и 1 10 мг/л бриллиантового зеленого, а в питательную среду с твердым носителем вводят дополнительно 20 100 мг/л ТМТД или 25 100 мг/л нистатина.

Похожие патенты:

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при диагностике гепатита В

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности, к получению штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, которые могут быть использованы для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов с целью идентификации и количественного определения уровня иммуноглобулинов G класса в биологических жидкостях организма свиньи

Мы создали собственную лабораторию и освоили технологию производства элитного посадочного материала голубики высокорослой , ежевики , жимолости съедобной , малины, брусники.

Культура in vitro – выращивание клеток, тканей, органов на искусственной питательной среде в абсолютно стерильных условиях при контролируемых физических факторах (свет, температура, влажность, фотопериодичность).

Микроклональное размножение – разновидность вегетативного размножения растений в культуре in vitro. Оно освоено на явлении тотипотентности (способность нести и восстанавливать генетическую информацию растений).

Преимущества микроклонального размножения

Метод обеспечивает высокий коэффициент размножения, что дает возможность быстро внедрить в производство новые сорта растений.
В процессе размножения обеспечивается оздоровление посадочного материала.
Требуется небольшое количество стартового материала.
Выполнение работ осуществляется в лабораторных условиях и не зависит от факторов внешней среды.
Возможность размножения растений, трудно размножаемых в естественных условиях.

Исходным материалом для введения растений в культуру обычно служат элитные растения, типичные для сорта и без признаков инфекции.

Этапы микроклонального размножения

I. Стерилизация эксплантов (любая часть растения, культивируемая в условиях in vitro). Введение в культуру in vitro. На этом этапе важно обеспечить успешное помещение экспланта на питательную среду, наблюдая тем самым растяжение тканей путем дифференциации клеток растения.
II. Собственно размножение. Целью этапа является увеличение числа побегов в культуре in vitro. Размножение на этом этапе является важным моментом. Индуцируются меристематические центры, которые развиваются в почке или побеге.
III. Укоренение и адаптация в нестерильных условиях. На этом этапе удлиняются побеги, индуцируются корни, затем осуществляется перенос в тепличные условия.

Получить больше информации

По вопросам IN-VITRO и для заказа саженцев — звоните или приезжайте .

В лаборатории

Купить саженцы различных культур для садоводов сейчас не составляет никакого труда. Их можно заказать в Интернете и увидеть на местных рынках. Ассортимент и диапазон цен очень широк, например, саженцы малины и ежевики можно найти по 5-7 грн, клубнику – по 2 грн, а за супер - новинки придется выложить несколько сотен гривен. Думаю, многие садоводы, заказывая посадочный материал, оставались не довольными их качеством. Чтобы конкурировать и снизить цену на саженцы производители не редко упрощают технологию, которую необходимо выдерживать на маточниках. В результате саженцы получаются слабые и болезненные.

Но садоводам и фермерам нужен качественный и здоровый посадочный материал за приемлемую цену. Выходом из ситуации может стать микроклональное размножение растений (in vitro , дословно в стекле) – новая технология вегетативного размножения растений, позволяющая в ограниченные сроки получить большое количество идентичных копий (клонов) исходного растения. Кроме непосредственно размножения, технология дает возможность избавиться от подавляющего большинства инфекций (вирусов, бактерий, грибов и т.д.), при условии соблюдения технологических приемов. За счет этого, растения после in vitro размножения обладают значительно лучшими характеристиками (сила роста, продуктивность, устойчивость к болезням и т.д.) по сравнению с исходными растениями. Такой посадочный материал относят к разряду супер-супер элиты.

Ответить на наши вопросы на тему «in vitro» любезно согласился Алексей Викторович - кандидат сельскохозяйственных наук с опытом работы с культурой тканей растений (микроклональное размножение).

«Biznesselo»: Алексей Викторович, расскажите какие растения можно размножать ин-витро?

Во-первых, начнем с того, что немного развеем мифы и заблуждения. Технология микроклонального размножения растений (англ., in vitro microclonal plant propagation) – очень старый и широко используемый во все цивилизованном мире метод быстрого размножения растительного материала. Первые протоколы сред для размножения были описаны физиологами растений Тошио Мурасиге и Фольке К. Скугом еще в далеком 1962 году. В настоящее время практически весь посадочный материал заграницей получают при использовании в той или иной мере метода in vitro.

Во-вторых, по своей сути ничего особо мистического и загадочного в методе нет, за исключением самого громкого названия. Это просто еще один хорошо модифицированный способ обычного вегетативного размножения, который позволяет в ограниченное время получить свободный от патогенов посадочный материал в больших или очень больших количествах.

Лаконично отвечая на Ваш вопрос – любые, с определенными ограничениями, связанными с особенностями роста тех или иных растений. Как правило, чем лучше растения размножаются в природе, тем выше будет коэффициент размножения и в культуре in vitro.

«Biznesselo»: Какие основные этапы микроклонального размножения?

● введение в асептическую культуру (стерильные условия);

● непосредственно размножение;

● адаптация (выведение из культуры in vitro) растений к условиям in vivo (обычным)

«Biznesselo»: Расскажите подробнее, как удается избавляться от бактерий, грибов и главное вирусов?

Во-первых, для введения в культуру in vitro используют точки роста растений, условно говоря, внутреннюю часть почки (апикальные меристемы), которые само растения защищает от патогенов. Во-вторых, на начальном этапе части растений (экспланты) обрабатывают веществами убивающие большинство патогенов (соли сулемы, перекись водорода, спирт и т.д.). И, наконец, в-третьих, во время культивирования и пересадки растений удаляются больные и зараженные бактериями и грибами.

Немного сложнее обстоят дела с вирусами. В этом случае или берут заранее здоровые от вирусов растения (проводят диагностику наличия вирусов методами молекулярной биологии, как при заболеваниях человека) или избавляются от вирусов методом термической терапии.

«Biznesselo»: Какая примерно себестоимость саженца in vitro (например, малина, земляника, ежевика) сравнительно с посадочным материалом, который был размножен традиционным способом?

Конечная цена определяется в основном ценами на энергоресурсы, стоимостью реактивов (химические соли и фитогормоны), поскольку растения длительное время “живут” в условиях искусственного освещения на специальных твердых субстратах (агаризированной среде). В среднем, стоимость одного in vitro саженца превышает стоимость обычного в 1,5 – 2 раза. При этом следует учитывать количество размножаемых растений, чем больше оборот, тем меньше себестоимость.

«Biznesselo»: Можно ли применять технологию ин-витро для получения новых сортов и видов растений?

Вопрос очень интересный. Одновременно и простой и сложный. Связано это со сложностью самого определения сорта. Как реально работающий в этой области молекулярный генетик могу однозначно сказать, что описательная морфология как главный критерий при регистрации того или иного сорта растений – это очередная кормушка для нечестных людей. Вы, наверное, удивитесь, но очень многие сорта это результат воровства друг у друга или вывезенные в кармане из-за границы растения, которые проявляют разные морфологические характеристики в других климатических зонах (в пределах фенотипической изменчивости). Любые попытки ввести в госреестр элементы генетического контроля происхождения сортов, на сегодняшний день, обречены по понятным нам всем причинам.

Так вот, культура in vitro позволяет отобрать из большого числа клонов устойчивые к химическим соединениям, абиотическим факторам и т.д. растения. Будут ли эти клоны новыми сортами вопрос скорее юридический, чем биологический.

Другое дело, что как составной элемент целого ряда направлений клеточной биологии, культура in vitro помогает получать новые виды, ранее в природе не существовавшие. Но это уже совсем другой разговор.

«Biznesselo»: Возможны ли мутации при микроклональном размножении?

Теоретически – да. Но как показывает мой опыт, при соблюдении элементарной этики работы доля растений с измененным фенотипом, статистически ничтожна.

«Biznesselo»: Какая приживаемость у in vitro растений?

Все in vitro саженцы – растения с закрытой корневой системой. Приживаемость такого посадочного материала – максимально возможная.

«Biznesselo»: Правда, что растения размножены микроклональным способом, более устойчивы к болезням и неблагоприятным погодным условиям?

Строго говоря, к абиотическим факторам – нет. С другой стороны любая устойчивость имеет полигенный характер, как проявления, так и наследования (работают одновременно много генов и их взаимодействия определяются ответом на конкретные условия, т.е. не всегда линейно и последовательно). Другими словами, если Вы не подкормили на зиму растения и не укрыли незимостойкие, никакие технологии не спасут от вымерзания. Но, если Вы все необходимые процедуры выполнили, то устойчивость оздоровленных растений будет выше. При этом никаких статистически достоверных подтверждений такой устойчивости я привести не могу.

С патогенами ситуация более понятна: однозначно in vitro саженцы имеют конкурентные преимущества по сравнению с обычными. Они изначально здоровы, поэтому развиваются и плодоносят быстрее. А уже взрослые растения (в зависимости от сортовых особенностей конечно) сами могут за себя “постоять”.

«Biznesselo»: Мы планируем заложить маточник малины и земляники. Какой класс растений вы бы посоветовали использовать?

Здоровые и районированные. Как мне кажется, работы по закладке маточника нужно начинать не с растений, а анализа почвы и климатических условий. При этом любые агротехнические приемы способны повышать урожайность. Например, для всех нам известного картофеля, удаление соцветий в стадии бутонизации способно повышать конечный валовый выход продукции до 10 %. То же самое относится и к окучиванию, фумигации, корневым подкормкам и т.д. Я уже не говорю про предварительное выращивание сидератов как способа обогащения почвы и борьбы с сорняками.

Поэтому, для раскрытия генетического потенциала растения нужно создать оптимальные условия. Без серьезной предварительной работы выбор класса саженцов не имеет значения.

Наша компания на основе технологии клонального микроразмножения растений производит посадочный материал трёх категорий:

Микрорастения in vitro , сокращенное обозначение “In Vitro ” (рис. 1)
Микрорастения in vitro неукоренненные - in vitro Н.У.
Адаптированный посадочный материал с закрытой корневой системой (ЗКС), сокращенное обозначение “Ex Vitro (ЗКС) ”

В этой статье мы с Вами рассмотрим производство микрорастений In Vitro .

Микрорастения in vitro – это посадочный материал нового поколения, обладающий рядом неоспоримых преимуществ по сравнению с растениями, полученными традиционными методами размножения (отводки, черенкование, прививка), а именно:

Растения свободны от фитопатогенов;
Обладают повышенными темпами роста и развития, а в некоторых случаях и более ранним началом цветения и плодоношения;
Высокая выравненность посадочного материала вследствие его генетической однородности;
Возможность размножения в неограниченных количествах гибридных форм растений, с сохранением всех ценных признаков;
Отсутствие сезонности при производстве посадочного материала;
Возможность производства больших объемов посадочного материала в сжатые сроки;
Относительно низкая стоимость по сравнению с классическими типами посадочного материала.

Выращивание микрорастений в стандартизированных условиях обеспечивает высокую степень однородности посадочного материала между различными партиями, что дает возможность нашим клиентам более точно планировать объемы и сроки посадок.

Герметичная пластиковая тара и питательный субстрат, в котором выращиваются микрорастения, дают возможность транспортировки продукции на дальние расстояние с сохранением жизнеспособности и посадочных качеств микрорастений, что подтверждается широкой географией наших постоянных клиентов. Компактность упаковки и небольшой вес контейнеров значительно уменьшают транспортные расходы.

Особенности данного способа размножения позволяют в сжатые сроки получать омоложенный оздоровленный посадочный материал как старых, но не теряющих свою актуальность, сортов так и селекционных новинок.

Недостатки:

Основной сложностью при работе с микрорастениями является процесс их адаптации к естественным условиям. Проведение адаптации микрорастений требует определенных навыков и наличия теплиц для первичного доращивания растений in vitro. Адаптация производится в условиях повышенной влажности и с применением других специальных мер по уходу (см. рекомендации по уходу). Требуемые условия необходимо соблюдать в первые 3-5 недель (в зависимости от вида растений) после высадки микрорастений в субстрат. Допустимый выпад (гибель) микрорастений при соблюдении оптимальных условий адаптации составляет 5 – 10% в зависимости от культуры и сорта.

Ключевым потребителем продукции категории "микрорастения in vitro " являются тепличные хозяйства, располагающие зимними отапливаемыми теплицами (агрофирмы, тепличные комбинаты, питомники, фермерские хозяйства и т.д.).

Также мы производим микрорастения флоксов in vitro неукоренненные - in vitro Н.У.

Совмещение стадий укоренения и адаптации микропобегов флоксов открывает возможность увеличения эффективности производства для этой культуры и позволяет значительно сократить сроки получения готовых растений.

Наличие меристематических очагов, дающих начало корневым зачаткам, позволяет растению развить полноценную корневую систему
Высадка в теплицу, уход и доращивание не требуют дополнительных усилий
Микрорастения имеют высокую приживаемость
По морфологическим показателям микрорастения не отличаются от укорененных in vitro